液相色譜(HPLC)含量測(cè)定是一種通過(guò)高效液相色譜法來(lái)分析樣品中特定成分含量的實(shí)驗(yàn)方法。

利用高壓輸液泵將流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)樣品進(jìn)行分離和測(cè)定，這是液相色譜(HPLC)含量測(cè)定的原理。樣品由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。

在含量測(cè)定過(guò)程中，首先需要制備供試品溶液和對(duì)照品溶液。供試品溶液是通過(guò)用規(guī)定的溶劑提取精制要測(cè)試的供試品而制成的，其濃度適宜。對(duì)照品溶液是根據(jù)供試品所要測(cè)定的成分取相應(yīng)的對(duì)照品，用適宜的溶劑配制成相應(yīng)濃度的溶液。

總的來(lái)說(shuō)，液相色譜含量測(cè)定是一種準(zhǔn)確、靈敏的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)藥物、制劑研究等領(lǐng)域。

下面就來(lái)重點(diǎn)說(shuō)說(shuō)含量測(cè)定的液相色譜方法學(xué)驗(yàn)證操作過(guò)程要點(diǎn)吧，經(jīng)典干貨，拋磚引玉供同仁們參考。

一、方法摸索優(yōu)化

? 操作過(guò)程

目標(biāo)優(yōu)化梯度條件，確定分析波長(zhǎng)。

1、樣品溶劑選擇；

2、濾膜吸附試驗(yàn)；

3、DAD檢測(cè)器下，波長(zhǎng)選擇主成分最大吸收或平臺(tái)處；

4、分離條件選擇；

5、色譜柱對(duì)比(根據(jù)情況酌定) ；

6、DAD檢測(cè)器下，水、1mol/l酸、堿、氧(10%雙氧水)、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料(制劑研究時(shí)需同時(shí)進(jìn)行空白輔料破壞)等成分分離。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、一般在無(wú)參考標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)的方法無(wú)法直接套用時(shí),需進(jìn)行此項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對(duì)樣品有很好的溶解能力，實(shí)驗(yàn)室自然放置穩(wěn)定存放12小時(shí)以上，與流動(dòng)相有良好的互溶效果。

3、續(xù)濾液峰面積達(dá)穩(wěn)定最大值，續(xù)濾液體積在5ml以下時(shí)較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右(5%-15%)為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時(shí)無(wú)破壞即視為樣品穩(wěn)定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時(shí)，樣品粉末及溶液需要同時(shí)做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調(diào)整至流動(dòng)相pH方可進(jìn)樣，可避免對(duì)色譜柱產(chǎn)生不良影響。如果破壞超過(guò)20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測(cè)定無(wú)干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有最高洗脫能力過(guò)程，目的證明所有的雜質(zhì)成分均能夠被洗脫檢測(cè)。

7、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)一般是不上資料的，只是體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)記錄本中，除非是沒(méi)有方法依據(jù)時(shí)，如3類藥申報(bào)時(shí)，梯度選擇及波長(zhǎng)選擇等均需要在資料中體現(xiàn)。

8、方法優(yōu)化完成后，最后在同一天同一人，用同一臺(tái)機(jī)器，對(duì)所有樣品進(jìn)行分析測(cè)定，具有可比性。

9、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用工藝已經(jīng)確定的實(shí)驗(yàn)室小試、實(shí)驗(yàn)室放大樣品進(jìn)行，前期用于原料合成樣品配合檢測(cè)時(shí)，可以采用大范圍的梯度洗脫進(jìn)行模糊檢測(cè)分析。

二、專屬性

? 操作過(guò)程

目的為了驗(yàn)證方法對(duì)目標(biāo)成分檢測(cè)的區(qū)分能力及全面的雜質(zhì)分析評(píng)價(jià)。DAD檢測(cè)器或適宜的通用型檢測(cè)器下，水、1mol/l酸、堿、氧(10%雙氧水)、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質(zhì)對(duì)照品等在同一天進(jìn)行分析，可以作為申報(bào)資料中雜質(zhì)譜的論述內(nèi)容。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、參照上述過(guò)程進(jìn)行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測(cè)定無(wú)干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有最高洗脫能力過(guò)程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺(tái)機(jī)器，對(duì)所有樣品進(jìn)行分析測(cè)定，具有可比性。

5、本部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)資料，最好采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。當(dāng)色譜條件與有關(guān)物質(zhì)檢查方法相同時(shí)，專屬性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以共用。出圖時(shí)主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

三、檢測(cè)限

? 操作過(guò)程

信噪比法，S/N≥3倍時(shí)的濃度為檢測(cè)限。

? 技術(shù)要點(diǎn)

先進(jìn)空白，再進(jìn)對(duì)照品濃溶液(1mg/ml)，在主峰相同位置處選擇空白溶劑1-2min范圍的基線積分得出峰高，按照峰高的3倍計(jì)算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，資料中體現(xiàn)至少3張圖(空白溶劑、濃溶液、及稀釋液)。

四、定量限

? 操作過(guò)程

信噪比法，S/N≥10倍時(shí)的濃度為定量限。

? 技術(shù)要點(diǎn)

按照基線峰高的10倍計(jì)算樣品濃度，直接用檢測(cè)限濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算峰面積RSD<2%(可以放寬至5%)，資料中體現(xiàn)6張圖(6張稀釋液)。與檢測(cè)限在同一天做，出圖時(shí)縱軸標(biāo)尺與檢測(cè)限一致，減少審評(píng)員審圖時(shí)的信息誤導(dǎo)，提高審圖效率。

五、線性與范圍

? 操作過(guò)程

5點(diǎn)或7點(diǎn)法，酌情設(shè)置。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、第一個(gè)點(diǎn)在定量限濃度，中間點(diǎn)為100%濃度，最后一個(gè)點(diǎn)為200%濃度(160%或180%)，必須采用稀釋法，不得采用調(diào)整進(jìn)樣量的方式。r>0.999。

2、采用對(duì)照品進(jìn)行。

3、線性范圍一定要將回收率試驗(yàn)的最高濃度包含進(jìn)去，否則回收率濃度超過(guò)線性范圍，缺乏定量依據(jù)，這個(gè)錯(cuò)誤非常常見(jiàn)。

六、精密度

? 操作過(guò)程

同一份供試品(樣品)溶液，連續(xù)進(jìn)6次。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、計(jì)算峰面積RSD<2%，資料中體現(xiàn)7張圖(1張空白，6張樣品液)。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

七、溶液穩(wěn)定性

? 操作過(guò)程

與精密度在同一天穿插進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行良好的排序設(shè)置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時(shí)間點(diǎn)必做(除非已知穩(wěn)定性情況可減少時(shí)間點(diǎn))。0、4、6、8、10、12、18、24。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

2、做7至8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在撰寫(xiě)申報(bào)資料時(shí)最后以6個(gè)數(shù)據(jù)填報(bào)。

3、溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)至少做到16h穩(wěn)定(盡量做得更長(zhǎng)時(shí)間，都是自動(dòng)進(jìn)樣，一個(gè)過(guò)夜就至少在12小時(shí)以上，時(shí)間太短無(wú)法證明溶液穩(wěn)定性)，極特殊情況下可以采用低溫進(jìn)樣器或特殊的保存方法或現(xiàn)配現(xiàn)分析等操作，但要求有數(shù)據(jù)作為支持依據(jù)，方可將特殊處理方法定入標(biāo)準(zhǔn)。

4、6個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算峰面積RSD<2%。

八、重復(fù)性

? 操作過(guò)程

同一批號(hào)樣品，同一人員同法操作分別稱取2份對(duì)照品及6份供試品(樣品)溶液，各進(jìn)1次。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、計(jì)算含量RSD<2%，資料中體現(xiàn)9張圖(1張空白，2張對(duì)照，6張樣品)。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

九、中間精密度

? 操作過(guò)程

同一批號(hào)樣品，不同人員，不同設(shè)備，同法操作，分別稱取2份對(duì)照品及6份供試品(樣品)溶液，各進(jìn)1次。推薦次日操作，避免產(chǎn)生壓針的疑問(wèn)(萬(wàn)一審評(píng)老師沒(méi)有注意到設(shè)備編號(hào)，所以別自找麻煩，推薦次日操作)。對(duì)照品也要重新稱取。

? 技術(shù)要點(diǎn)

與重復(fù)性的6個(gè)數(shù)據(jù)，共同參與統(tǒng)計(jì)，計(jì)算12個(gè)含量數(shù)據(jù)結(jié)果，RSD<2%，資料中體現(xiàn)18張圖，其中重復(fù)性9張，次日數(shù)據(jù)9張(1張空白，2張對(duì)照，6張樣品)。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

十、準(zhǔn)確度

? 操作過(guò)程

采用回收率試驗(yàn)方式進(jìn)行，通常采用直接回收率實(shí)驗(yàn)法，按照80%、100%、120%比例分別稱取樣品，同法操作，每個(gè)比例各3份樣品，各進(jìn)1次。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、以中間精密度的含量均值作為理論含量，計(jì)算回收率，回收率變動(dòng)范圍98%-102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖(1張空白，2張對(duì)照，9張樣品)。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

2、原料藥采用直接回收率。

3、制劑采用加樣回收率測(cè)定：采用20片或粒制劑單位終產(chǎn)品混合研碎后，按比例稱取進(jìn)行加樣回收，加樣回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達(dá)標(biāo)時(shí)(輔料有吸附或干擾較大時(shí))，方可采用直接回收率?；厥章首儎?dòng)范圍98%-102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖(1張空白，2張對(duì)照，9張樣品)。

十一、耐用性實(shí)驗(yàn)

? 操作過(guò)程

改變色譜柱。不同品牌的色譜柱，共3個(gè)品牌。比較分離度，保留時(shí)間，含量測(cè)定結(jié)果。如果品牌不足3個(gè)可采用多個(gè)批號(hào)或不同品牌多個(gè)批號(hào)的方式，不能采用廢柱子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)品牌的色譜柱共15張圖(每個(gè)色譜柱1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張)，各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

十二、流動(dòng)相比例

? 操作過(guò)程

流動(dòng)相的低組分比例變化約±5%。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同比例的流動(dòng)相15張圖(每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張)，各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認(rèn)。

十三、流速變化

? 操作過(guò)程

流速±10%。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同流速的流動(dòng)相15張圖(每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張)，各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認(rèn)。

十四、不同pH

? 操作過(guò)程

pH值±0.2。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和兩份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同pH的流動(dòng)相15張圖(每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張)，各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認(rèn)。

十五、柱溫

? 操作過(guò)程

柱溫±5℃25℃、30℃(或最優(yōu)參數(shù))、35℃。

? 技術(shù)要點(diǎn)

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和一份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同溫度15張圖(每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張)，各條件下的含量數(shù)據(jù)(n=6)的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問(wèn)題無(wú)法確認(rèn)。

十六、0天樣品檢測(cè)

? 操作過(guò)程

方法學(xué)研究結(jié)束且各項(xiàng)考察數(shù)據(jù)符合要求后，對(duì)3批生產(chǎn)線驗(yàn)證樣品及被仿品在同一天進(jìn)行檢測(cè)。此數(shù)據(jù)在申報(bào)資料產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告單中體現(xiàn)，且可作為穩(wěn)定性的0天數(shù)據(jù)。

? 技術(shù)要點(diǎn)

雙樣雙針。對(duì)照品也為雙樣雙針。