液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，指液相色譜和質(zhì)譜兩套分析系統(tǒng)的“聯(lián)用”。

色譜的優(yōu)勢在于分離，為混合物的分離提供了最有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品對比來判斷未知物，對無紫外吸收化合物的檢測還要通過其它途徑進(jìn)行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進(jìn)行純化，具有一定的純度之后才可以直接進(jìn)行分析。兩套系統(tǒng)聯(lián)用可發(fā)揮出更大的優(yōu)勢。

液質(zhì)聯(lián)用中的液相色譜

液相色譜的構(gòu)造分為五大部分：進(jìn)樣部分(手動進(jìn)樣或自動進(jìn)樣)，驅(qū)動液體流動的色譜泵，主導(dǎo)分離的色譜柱(有些配柱溫箱)，檢測器、數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)。

當(dāng)同質(zhì)譜聯(lián)用時，質(zhì)譜成為液相色譜的檢測器，而為了同步數(shù)據(jù)采集及分析，色譜廠商通常開放接口，讓質(zhì)譜廠商的軟件來控制液相色譜的進(jìn)樣和分離，數(shù)據(jù)分析也交給質(zhì)譜廠商。

液相色譜結(jié)構(gòu)圖

當(dāng)液質(zhì)聯(lián)用時，通常在色譜柱前端加裝短的保護(hù)柱來延長色譜柱壽命。若固定相使用未經(jīng)修飾的氧化硅顆?；蛐揎椘渌邩O性物質(zhì)，如氨基或氰基，則成為正相色譜，適合分析極性較強的分析物，洗脫時可通過調(diào)配極性差異大的兩種流動相溶液(如水和乙腈)比例，而得到適當(dāng)極性的單一流動相溶液進(jìn)行等度洗脫。在復(fù)雜樣品中，若要獲得好的分離度，可以使用極性差異大的兩種流動相溶液(如水和乙腈)進(jìn)行梯度洗脫。若固定相為經(jīng)過C18、C8或苯基柱，則稱為反相色譜，適合分析低極性的化合物，亦可以進(jìn)行等度或梯度洗脫。

在聯(lián)用中，大都使用內(nèi)徑2.1mm或1mm的色譜柱，其流動相流速分別為約200-300 μL/min和50-75μL/min，有些情況下可使用4.6mm的色譜柱，其流動相流速為1mL/min，這時一般會在進(jìn)入質(zhì)譜前進(jìn)行分流，讓少部分進(jìn)入質(zhì)譜，而大部分分流后可進(jìn)行回收。

超高效液相色譜分離時，固定相顆粒從5μm降至3μm與1.7μm以下，這時分離效率更高，但同時需要超高壓液相泵(>400 bar或>6000psi)，這時分離時間縮短到數(shù)分鐘內(nèi)且不損失分離效能。在超高效液質(zhì)聯(lián)用時，其色譜峰底寬約在數(shù)秒內(nèi)，因此在質(zhì)譜方法設(shè)定上，需適當(dāng)調(diào)整掃描速度以獲得足夠質(zhì)譜圖數(shù)，從而完整描繪色譜峰。

納升級流速液質(zhì)聯(lián)用常用于蛋白質(zhì)組學(xué)等復(fù)雜微量樣品的分析。

降低柱內(nèi)徑可以得到較低的死體積，同時柱效大幅提高。例如，若原本用2.1mm的色譜柱分析樣品，當(dāng)轉(zhuǎn)換至使用內(nèi)徑75μm毛細(xì)管柱且注入相同樣品濃度時，理論上樣品峰濃度將會增加至約784倍。因此使用毛細(xì)管色譜柱對于電噴霧質(zhì)譜儀(濃度靈敏檢測器)的信號提升將非常顯著。此時，達(dá)到理想理論塔板數(shù)的最佳流速約為255 nL/min，理想進(jìn)樣體積約24nL，這時需要更細(xì)微的注射器，不易實現(xiàn)。

目前普遍的做法是，利用柱前端在線預(yù)濃縮方式，將微升級的樣品體積濃縮在色譜柱的最前端以縮小樣品體積。另一方面，由于樣品承載量減少，超載的樣品量容易造成柱分離效率降低。為解決此問題，可在色譜分離柱的前端加入一個捕集柱(Trap Column)，捕集柱的功能包含了樣品預(yù)濃縮與去除過多的樣品量。為匹配納升級流速，一般需要納升電噴霧接口。商品化的納升級流速液質(zhì)聯(lián)用構(gòu)建上，常使用一個六通閥連接捕集柱與分離柱，在捕集柱進(jìn)行預(yù)濃縮時同時去除大部分樣品中的鹽類，濃縮后洗脫樣品到分離柱進(jìn)行樣品分離。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜

質(zhì)譜主要由樣品入口、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測器(許多質(zhì)譜的離子源)均在真空中，由真空泵來提供所需真空度。

質(zhì)譜主要測定的是帶電離子的質(zhì)量，即質(zhì)荷比(m/z)。在液質(zhì)聯(lián)用中，樣品入口即液相色譜的流出端接入離子源，在離子源和質(zhì)量分析器之間的離子傳輸也挺重要。

質(zhì)譜結(jié)構(gòu)示意圖

質(zhì)譜離子化方法

? 電噴霧電離(ESI)

電噴霧離子源能夠?qū)⑷芤褐械膸щ婋x子在大氣壓下，經(jīng)由電噴霧過程轉(zhuǎn)換為氣相離子，再導(dǎo)入質(zhì)譜儀分析。除了大分子的分析，電噴霧也適用于分析極性小分子，并具有高靈敏度，同時非常容易與HPLC在線聯(lián)用，因此是LC-MS的最主要離子源接口。

? 納噴霧電離(Nanospray Ionization)

利用石英毛細(xì)管制成內(nèi)徑約1μm的噴嘴，可在25nL/min極低流速下穩(wěn)定電噴霧，這即被稱為納噴霧離子源。這時的噴針和入口方向是平行甚至直對質(zhì)譜入口，且能承受溶液中較高濃度鹽類污染物的影響，基質(zhì)效應(yīng)較不明顯。廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，且近年來出現(xiàn)了很多納升流速的液相色譜儀，從而使LC-MS稱為微量分析的利器。

? 大氣壓化學(xué)電離(APCI)

將原GC-MS上使用的CI化學(xué)電離方法擴(kuò)展到大氣壓下進(jìn)行，基本原理是離子/分子反應(yīng)，但APCI借助電暈放電產(chǎn)生試劑離子。此方法利用高電壓(5-6kV)金屬針放電產(chǎn)生等離子體區(qū)域，通常以氮氣作為試劑氣體，經(jīng)由電暈放電產(chǎn)生一次離子，再與汽化的溶劑反應(yīng)，產(chǎn)生二次反應(yīng)氣體粒子，再與溶質(zhì)進(jìn)行離子/分子反應(yīng)，如發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使被分析物離子化。APCI更適用于弱極性/中等極性的小分子，其在僅有電場作用的ESI下難以離子化。

? 大氣壓光致電離(APPI)

利用光能激發(fā)氣態(tài)被分析物分子，使其離子化為自由基離子，或進(jìn)一步將被分析物質(zhì)子化生成離子。APPI有時也使用摻雜劑如甲苯、丙酮來幫助被分析物離子化，具有分析極低極性或非極性物質(zhì)的能力。

? 常壓敞開式電離

解吸電噴霧電離(Desorption Electrospray Ioniztion，DESI)和 實時直接分析(Direct Analysis in Real Time，DART) 統(tǒng)稱為常壓敞開式離子化(Ambient Ionization)。常壓敞開式離子化法適合分析存在于物體表面的物質(zhì)，可在現(xiàn)場分析，分析速度快，在環(huán)境檢測、食品安全、犯罪物證鑒定、臨床標(biāo)志物檢測等需要快速現(xiàn)場分析的領(lǐng)域具有前景；在近年來高熱度的質(zhì)譜成像、空間定位組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)表了許多前沿成果。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：質(zhì)量分析器

在離子源離子化后，離子經(jīng)過離子傳輸部分(習(xí)慣上稱為Q0區(qū))進(jìn)入后續(xù)的質(zhì)量分析器。

質(zhì)量分析器有這七種：扇形磁場、四極桿、離子阱、飛行時間、FTICR、Orbitrap、Astral。扇形磁場常配合EI源使用，所以在LC-MS中不再介紹。下面分別介紹其它6種。

? 四極桿Quadruple

其原理是控制離子隨著交流(AC)、直流(DC)電場運動。在特定電場作用下，離子運動軌跡與質(zhì)荷比有關(guān)，如果運動軌跡不穩(wěn)定就會撞擊分析器的電極或偏離電場區(qū)無法被利用。簡而言之，通過控制電場可選擇特定質(zhì)荷比的離子穩(wěn)定地通過四極桿到達(dá)檢測器。

? 離子阱Ion Trap

屬于四極質(zhì)量分析器，不同的是在z軸增加了一個束縛場，形成一個可以捕獲離子的三維電場。它由一對環(huán)形電極和一對上下對稱的端蓋電極組成，這些電極的幾何形狀為雙曲面。當(dāng)離子阱要捕獲所有離子時，常關(guān)閉直流電場僅保留交流電場。當(dāng)掃描離子時，在環(huán)形電極加入射頻場(即交流電場)，而上下端蓋電極則同時接地。通過掃描環(huán)形電極的交流電場可使離子逼近不穩(wěn)定區(qū)而離開離子阱進(jìn)入檢測器。

? 二維線性離子阱Linear Trap

三維離子阱的容量較小，有效捕獲區(qū)域小，為了增加離子阱的容量、提升靈敏度、分辨率等性能，質(zhì)譜學(xué)家們設(shè)計了二維線性離子阱，即在二維四極桿的軸向方向，用電場將離子束縛起來，可將被捕獲離子的數(shù)量從百萬個提升到千萬個。

? 飛行時間TOF

利用靜電場加速離子后，以離子飛行速度差異來分離不同質(zhì)荷比的離子。在施加同樣能量的電場后，離子進(jìn)入一個無場的飛行管，質(zhì)荷比大的離子飛得慢，質(zhì)荷比小的離子飛得快。TOF的突出優(yōu)點是：在分辨率、靈敏度、速度方面均有不錯的綜合表現(xiàn)，反射型TOF常?？梢垣@得超過10,000的高分辨，全掃描時的譜圖采集速度很快。

? 傅里葉變換離子回旋共振FT-ICR

FT-ICR的質(zhì)量分析器由捕獲電極、激發(fā)電極和檢測電極組成，其結(jié)構(gòu)可以是立方體、圓柱形或長方體等。離子在均勻的磁場中做回旋運動，當(dāng)離子回旋頻率與激發(fā)電極發(fā)出的射頻電場頻率相當(dāng)而產(chǎn)生共振時，離子運動半徑會逐漸擴(kuò)大到足以在兩個平行的檢測電極上感應(yīng)產(chǎn)生像電荷。此時關(guān)閉激發(fā)電極的無線電場，并記錄像電荷形成時域的ICR信號，使用傅里葉變換可將時域信號轉(zhuǎn)換成頻域譜圖，譜圖中的頻率為離子質(zhì)量與電荷的函數(shù)，所以可以直接轉(zhuǎn)換為質(zhì)譜圖。值得注意的是，F(xiàn)T-ICR不需要將離子傳送到檢測器中，它檢測的是感應(yīng)信號。

? 軌道阱Orbitrap

利用直流電場將離子局限于阱中，并運用傅里葉變換技術(shù)將時域信號轉(zhuǎn)換到頻域，再經(jīng)換算得到離子的質(zhì)荷比信號。離子被局限在固定的軌道內(nèi)長時間高速周期運動，因此可獲得數(shù)十萬甚至上百萬的高分辨率。在獲得與FT-ICR近似分辨率性能的同時，Orbitrap不使用強磁場而使用直流電場，使用簡單、維護(hù)成本低，是近年來質(zhì)譜領(lǐng)域的重大突破。

? 非對稱軌道無損質(zhì)量檢測器(Asymmetric Ion Mirrors, Astral)

目前它主要用于和Orbitrap配合使用，主要用于串聯(lián)MS/MS檢測?？傮w原理有點像多次往返的TOF，但離子的飛行軌道和傳統(tǒng)TOF非常不同。它的主要特點是：可以在高達(dá)200 Hz的速度下碎裂離子，同時分辨率達(dá)到8萬。Astral不是TOF，而是結(jié)合了TOF、離子阱和Orbitrap技術(shù)的一種新型分析器。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：檢測器

? 電子倍增器(Electron Multiplier，EM)

離散金屬板的串聯(lián)連接，可將離子電流放大約108到可測量的電子電流。原理是讓離子撞擊到容易釋放出二次電子的材質(zhì)表面，二次電子經(jīng)由重復(fù)撞擊相同材質(zhì)連續(xù)放大二次電子數(shù)目后，再記錄二次電子數(shù)量來達(dá)到檢測目的。電子倍增器依據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為不連續(xù)式與連續(xù)式兩種，前者面積大但動態(tài)范圍寬，后者面積小適用于空間有限的分析器，但動態(tài)范圍窄?？偟膩碚f，電子倍增器的響應(yīng)時間約為20ns，不適合TOF，常用于四極桿、離子阱。

? 微通道板(Microchannel Plate，MCP)檢測器

微通道板MCP類似于連續(xù)式電子倍增器，只是它將每個微小化的電子倍增器做成數(shù)組形態(tài)，并集中在一只半導(dǎo)體圓盤上。由于電流信號的時間半高寬通常小于2ns，適用于TOF。MCP最常見的結(jié)構(gòu)為二片堆疊式，當(dāng)離子撞擊進(jìn)入MCP中，其效果類似于連續(xù)式電子倍增器，二次電子反復(fù)撞擊通道內(nèi)部表面產(chǎn)生大量二次電子。MCP的優(yōu)點是檢測面積大、增益值高、反應(yīng)速度快、甚至可搭配熒光屏或數(shù)組式收集信號電極變成離子圖像檢測器。

? 無增益式離子檢測器

本身不放大離子信號，只作為收集離子電流或感應(yīng)離子電荷的簡單裝置。其結(jié)構(gòu)主要由檢測離子的電極和在后端的信號放大電路構(gòu)成。一般用來檢測離子的電極稱做法拉第電極，而此電極依其形狀又常被稱為法拉第板或法拉第杯。法拉第杯通常直接放置在離子路徑上收集離子，而法拉第板則可直接收集離子或安裝于離子路徑旁感應(yīng)離子信號。

? 閃爍檢測器(Scintillation Detector)

也稱達(dá)利檢測器(Daly Detector)，其原理也是離子轉(zhuǎn)換為二次電子，但產(chǎn)生二次電子數(shù)目沒有被放大，而是直接加速撞擊高效率的熒光屏后發(fā)光，然后光子再由極為靈敏的光電倍增管檢測并放大成電子信號。該檢測器的增益比高，但只適用于正離子，信號響應(yīng)時間長，且需要高真空，體積較大。許多早期使用該檢測器的質(zhì)譜都已改成電子倍增器。目前，商業(yè)質(zhì)譜儀常以轉(zhuǎn)換二次發(fā)射電極搭配電子倍增器使用，來增加儀器靈敏度。

液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜：真空系統(tǒng)

真空是質(zhì)譜儀運作的必要條件之一，也是操作質(zhì)譜儀前首先要準(zhǔn)備的工作。真空度越高，代表氣體壓力越低。大多數(shù)質(zhì)譜儀都必須串聯(lián)低真空及高真空兩種泵，而且開啟時必須循序啟動。質(zhì)譜常用真空泵有三類。

? 粗抽泵(Roughing Pump)

適用于1000~10^-3 mbar。機械泵(Mechanical Pump)、隔膜泵(Diaphragm Pump)及渦卷式泵(Scroll Pump)都屬于粗提泵，或前級泵(Fore Pump)，需要機油潤滑和經(jīng)常性保養(yǎng)，運轉(zhuǎn)時會產(chǎn)生噪聲和高溫。

? 高真空泵(High Vacuum Pump)

適用于10^-4~10^-9 mbar。渦輪分子泵(Turbomolecular Pump)、擴(kuò)散泵(Diffusion Pump)及低溫泵(Cryopump)屬于高真空泵。渦輪泵和擴(kuò)散泵都必須在排氣口連接一個粗提泵。一般液質(zhì)聯(lián)用上使用的高真空泵均為渦輪分子泵。

? 超高真空泵(Ultrahigh Vacuum Pump)

適用于10^-4~10^-11 mbar。包括低溫泵和離子泵(Ion Pump)，可將腔體內(nèi)壓力降到超高真空。但低溫泵需超低溫，離子泵體積特別大。超高真空壓力范圍也可以串聯(lián)幾個分子渦輪泵來實現(xiàn)。

液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。