什么是色譜柱？

色譜法是一種分離混合物中各組分的分析技術(shù)。色譜柱是色譜中使用的儀器的一部分。使用柱的五種色譜方法是氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、離子交換色譜(IEC)、尺寸排阻色譜(SEC)和手性色譜。色譜的基本原理可以應(yīng)用于所有五種方法，其中，氣相色譜柱和高效液相色譜柱是使用率高的兩種方法。

? 氣相色譜柱

在氣相色譜中，流動(dòng)相是氣體。氣相色譜柱的長(zhǎng)度通常在1-100m之間。氣相色譜法(GC)：液相固定相結(jié)合或吸附到毛細(xì)管柱的表面上，或結(jié)合到柱內(nèi)填充的固體載體上。匹配分析物和固定相的極性兩者具有相似的極性，固定相的厚度在0.1-8 μm之間，而厚度越厚，分析物的揮發(fā)性就越大。

? 高效液相色譜柱

高效液相色譜(HPLC)是液相色譜的一種。液相色譜柱共有三種基本類型：液-液、液-固和離子交換。液-液色譜柱不那么受歡迎，因?yàn)樗鼈兊姆€(wěn)定性有限且不方便。在液-固色譜柱中，固定相為固體，分析物吸收到固定相上，從而分析混合物的成分。通常，HPLC在分析柱之前有一個(gè)保護(hù)柱，以保護(hù)并延長(zhǎng)分析柱的使用壽命。保護(hù)柱的作用是去除色譜柱上不可逆的顆粒物、污染物和分子等。

簡(jiǎn)言之，色譜柱是裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。

色譜柱的分類

1、根據(jù)固定相極性的不同可分為極性色譜柱和非極性色譜柱；

2、根據(jù)固定相和流動(dòng)相的相對(duì)極性的不同可分為正相色譜柱和反相色譜柱；

3、根據(jù)色譜柱填充劑的差別可分為硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱、玻璃微球柱等。在化學(xué)鍵合硅膠柱中以十八烷基鍵合硅膠柱應(yīng)用最廣泛，辛基硅烷鍵合硅膠柱次之，即通常所說的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用；

4、根據(jù)色譜柱內(nèi)徑的不同，液相色譜柱可分為微徑柱、分析柱、快速柱、半制備柱、制備柱等，適用于不同的分離分析目的。常用的普通分析柱，內(nèi)徑通常為4.6mm(3/16in )，柱長(zhǎng)15-25cm，填料粒徑5-10pm，用于常規(guī)的分離分析?？焖俜治鲋膬?nèi)徑一般為6mm或更大，柱長(zhǎng)30-80mm，填料粒徑為3pm或更小。半制備柱與制備柱，內(nèi)徑一般在6mm以上，用于半制備或制備目的。而微徑柱內(nèi)徑一般為1mm，甚至有更小內(nèi)徑的毛細(xì)管柱，與常規(guī)分析柱相比，需要特殊的裝填技術(shù)，并配合高精度的微流泵(nano pump)使用。

液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。

簡(jiǎn)言之，常見的分配柱填料有：碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(Octy/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、碳四柱(Butyl/C4)、碳一注(Methyl/C1)、陰離子交換柱(SAX)、陽(yáng)離子交換柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)。常見的吸附柱填料：硅膠柱。

選擇合適的色譜柱材料非常重要，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到分析分離的質(zhì)量和速度。舉例來講，對(duì)于填充柱而言，可選擇的固定相較多，柱容量較大，但是受柱長(zhǎng)的限制，分離能力有限，主要應(yīng)用于簡(jiǎn)單化合物的分離。

色譜柱分離材料的種類非常多，常見的有硅膠、C18、C8、C4、NH2等材料。硅膠是最早使用的分離材料之一，它可以完全分離很多雜質(zhì)和雜質(zhì)成分。其缺點(diǎn)是在酸性和堿性環(huán)境下易受損。C18是目前使用較廣泛的分離材料之一，其特點(diǎn)是對(duì)疏水性的菲和芳香族化合物有很好的分離效果。C8、C4、NH2則以其適合分離的化合物不同而被應(yīng)用。

不同的柱徑和柱長(zhǎng)也會(huì)影響分離效果。一般而言，柱徑越小，分離效果越好；柱長(zhǎng)越長(zhǎng)，則分離時(shí)間越長(zhǎng)，分離效果越好。分離效果與分辨率息息相關(guān)，分辨率即為兩個(gè)峰的最近出峰時(shí)間點(diǎn)與兩個(gè)峰高的平均寬度的比值。分辨率越高，兩個(gè)成分之間的差異越明顯，分離效果越好。

當(dāng)然，除了色譜柱本身的選擇和使用方法外，樣品前處理過程的質(zhì)量也是決定分離效果的關(guān)鍵因素之一。正確的樣品前處理過程能夠減少背景雜質(zhì)的干擾，保證分離后的組分純度。

色譜分離基本原理

在色譜法中存在兩相，一相是固定不動(dòng)的，叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，叫做流動(dòng)相。其分離原理就是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行分離的。

高效液相色譜儀的分離原理

含有樣品的流動(dòng)相液體通過固定于柱子或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面；當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，混合物中的各組分與固定相發(fā)生相互作用，由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

各色譜柱分離原理

1、反相色譜柱

分離原理：用鍵合非極性基團(tuán)的載體填充而成的色譜柱，根據(jù)物質(zhì)極性差異進(jìn)行分離，固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。

適用范圍：適用于大多數(shù)化合物,如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾體、脂類、脂肪酸、糖類、生物堿等含有非極性基團(tuán)的化合物。

常用色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)、苯基鍵合硅膠、硅膠等。

2、正相色譜柱

分離原理：用硅膠或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱，根據(jù)物質(zhì)極性差異進(jìn)行分離。固定相的極性大于流動(dòng)相的極性(也可使用含水流動(dòng)相，HILIC)。

適用對(duì)象：適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，如脂溶性維生素、甾體激素等。

常用色譜柱：硅膠、氨基鍵合硅膠、氰基鍵合硅膠等。

3、離子交換色譜柱

分離原理：以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離。

適用對(duì)象：適用于離子或可離解的化合物，如無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白質(zhì)等。

常用色譜柱：有機(jī)共聚物樹脂、硅膠微球離子交換劑、螯合樹脂等。

4、分子排阻色譜柱

分離原理：根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團(tuán)尺寸間的相對(duì)關(guān)系，對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離，大分子的物質(zhì)保留弱。

適用對(duì)象：用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等。

常用色譜柱：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物、高交聯(lián)度苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物。

5、手性拆分色譜柱

分離原理： 由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其他聚合物上制成手性固定相，通過引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而實(shí)現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體的拆分。

適用對(duì)象：光學(xué)異構(gòu)體。

常用色譜柱：纖維素、環(huán)糊精、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)等。

不同色譜柱的清洗方法

高效液相色譜柱是消耗品，會(huì)隨使用時(shí)間或進(jìn)樣的次數(shù)增加，出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰，柱效下降。需要定期進(jìn)行清洗和再生，不同的色譜柱清洗方法各不相同。

? 反相柱

分別用甲醇:水=90:10，純甲醇(HPLC級(jí))，異丙醇(HPLC級(jí))，二氯甲烷(HPLC級(jí))等溶劑作為流動(dòng)相，依次沖洗，每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的色譜柱體積，然后再以相反的次序沖洗。

? 正相柱

分別用正己烷(HPLC級(jí))，異丙醇(HPLC級(jí))，二氯甲烷(HPLC級(jí))，甲醇(HPLC級(jí))等溶劑做流動(dòng)相，順次沖洗，每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱不少于20倍的柱體積(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高)，注意使用溶劑的次序不要顛倒，用甲醇沖洗完后，再以相反的次序沖洗至正己烷，所有的流動(dòng)相必須嚴(yán)格脫水。

? 離子交換柱

長(zhǎng)時(shí)間在緩沖溶液中使用和進(jìn)樣，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降，用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽(yáng)離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。

另外，還可以選擇能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑為流動(dòng)相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復(fù)到新柱的水平的。如果柱子裝反了，可以調(diào)回來，但可能會(huì)造成柱內(nèi)擔(dān)體塌陷，在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。