液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、信號(hào)記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點(diǎn)。對(duì)高沸點(diǎn)、難氣化合物的混合物通過(guò)色譜柱和淋洗劑并以實(shí)現(xiàn)分離。應(yīng)用于生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境化學(xué)、石油化工等部門。

工作原理

系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。

儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

? 進(jìn)樣系統(tǒng)

一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。

? 輸液系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。

? 分離系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10-50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2-5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5-10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)，固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。

另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。

? 檢測(cè)系統(tǒng)

高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。

（1）紫外檢測(cè)器

該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光(或可見(jiàn)光)有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)：使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測(cè)下限為10-10g/ml)；線性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感；可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測(cè)器

凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低(檢測(cè)下限為10-7g/ml)，流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。

（3）熒光檢測(cè)器

凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測(cè)定，其靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-12～10-14g/ml)，痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用。

? 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

應(yīng)用

高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。

與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問(wèn)題理想的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。

高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

流動(dòng)相流速選擇

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。

對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求理想柱效，那就使用理想流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當(dāng)選用理想流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

濾膜選擇

1、常見(jiàn)濾膜

水系過(guò)濾膜，一般用于純水相的過(guò)濾。在過(guò)濾含有機(jī)相的混合溶劑時(shí)應(yīng)盡量避免使用水系濾膜，以防濾膜被溶解，因?yàn)樗禐V膜一般由醋酸纖維素類的材料制成，耐有機(jī)溶劑性能較差。

有機(jī)系濾膜，本身也能過(guò)濾水，但水比較難浸潤(rùn)有機(jī)系濾膜，有些有機(jī)濾膜在水中超聲幾分鐘使其浸潤(rùn)，或用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕后也可以用于水系溶劑過(guò)濾?？梢援?dāng)然也可以先過(guò)濾甲醇再過(guò)濾水。混合系濾膜也可以用于水系溶劑過(guò)濾。但是，水系濾膜相對(duì)經(jīng)濟(jì)。

油系溶劑，采用專用的油系過(guò)濾膜，用于有機(jī)溶劑的過(guò)濾。混合系濾膜也可以用于有機(jī)溶劑過(guò)濾。

另外，如果該用有機(jī)相的濾膜，用了水的濾膜，濾膜會(huì)被溶解掉，導(dǎo)致管路堵塞。如果該用水的濾膜，用了有機(jī)相的濾膜，則流動(dòng)相很難流下去。

2、微孔過(guò)濾膜

再生纖維素膜(Regenerated Cellulose Membranes，RC)為疏水型濾膜，具有非特異性吸附低，特別適合于除微粒過(guò)濾，其化學(xué)兼容性強(qiáng)，可以耐受大多數(shù)有機(jī)溶劑，其化學(xué)兼容性如下表所示。直徑50mm和47mm，孔徑0.45µm作為標(biāo)準(zhǔn)用于溶劑的超凈和脫氣過(guò)濾以及HPLC 流動(dòng)相的過(guò)濾。主要用于有機(jī)溶劑的過(guò)濾。

醋酸纖維素膜(Cellulose Acetate Membranes，CA)具有理想流速和熱穩(wěn)定性以及低吸附。0.2µm的濾膜適合于水溶液、緩沖液、血清和培養(yǎng)基的除菌過(guò)濾。0.45µm的濾膜適合于HPLC的流動(dòng)相過(guò)濾。關(guān)于得到膜吸附的公開結(jié)果是比較困難的，其與過(guò)濾的物質(zhì)、過(guò)濾的條件和采用的測(cè)定方法以及被測(cè)定的膜沒(méi)有被預(yù)先除菌有關(guān)。主要用于水相溶液的過(guò)濾。

硝酸纖維素(Cellulose Nitrate Membranes，CN)是理想的濾膜材料，其能提供非常一致的孔徑結(jié)構(gòu)和寬的孔徑規(guī)格。大的孔徑(8µm，5µm和3µm)用于趨藥性和細(xì)胞截留，0.45µm用于微粒收集，小孔徑(0.1µm)用于溶液的超凈過(guò)濾和光散射測(cè)量。這種類型濾膜所具有的非特異性吸附性能使其利于許多印跡處理過(guò)程和診斷試劑的應(yīng)用。用于樣品預(yù)處理，顆粒檢測(cè)或除顆粒。

聚四氟乙烯膜(PTFE Membranes，PTFE)采用PTFE材質(zhì)，即使在很低的壓差下，也能保證潮濕空氣或其它氣體通行無(wú)阻，而水溶液則不能透過(guò)。其性能與親水膜正好相反。PTFE濾膜具有強(qiáng)化學(xué)兼容性，能勝任所有的有機(jī)溶劑和強(qiáng)腐蝕化學(xué)品的過(guò)濾。在必須用PTFE濾膜過(guò)濾水相溶液時(shí)，須先用乙醇或異丙醇預(yù)浸潤(rùn)后，水相溶液才能濾過(guò)。用于空氣、氣體和疏水性化學(xué)品的過(guò)濾。

玻璃纖維濾膜(Glass Fiber Filters，GF)屬于深層過(guò)濾，其主要用途是作為于過(guò)濾層，直接加在過(guò)濾膜上使用。注意，不同尺寸的濾器對(duì)預(yù)過(guò)濾膜的直徑都有具體的要求，直徑過(guò)大時(shí)，其邊緣會(huì)伸到密封圈下引起漏液。用于提高過(guò)濾通過(guò)率和連續(xù)過(guò)濾。

尼龍膜(Polyamide Membranes，Nylon)具有理想機(jī)械強(qiáng)度，吸附性強(qiáng)，能耐受大多數(shù)有機(jī)溶劑和多數(shù)堿性溶液，適合于堿性溶液的過(guò)濾。用于有機(jī)溶劑過(guò)濾，如HPLC流動(dòng)相除顆粒過(guò)濾時(shí)，尼龍膜比PTFE膜更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，另外，尼龍膜還可作為轉(zhuǎn)印膜。由于尼龍膜的吸附性能相對(duì)較高，一般不推薦用于培養(yǎng)基過(guò)濾或蛋白液等生物樣品的過(guò)濾，以免因吸附而損失樣品。在這種情況下，通常采用低吸附的醋酸纖維素膜(CA)，更為適用。用于堿性溶液和有機(jī)溶劑過(guò)濾。

使用注意要點(diǎn)

1、流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)；

2、流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用；

3、不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液；

4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上；

5、長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉；

6、每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器；

7、C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品；

8、堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗。清洗方法：①以異丙醇作溶劑沖洗；②放在異丙醇中間用超聲波清洗；③用10％稀硝酸清洗；

9、氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡；

10、如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液，通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗；

11、要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品；

12、更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。

常見(jiàn)故障的斷定及解決

1、保留時(shí)間變化

? 柱溫變化，柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱；

? 等度與梯度間未能充分平衡，至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱；

? 緩沖液容量不夠用，25mmol/L的緩沖液；

? 柱污染，每天沖洗柱；

? 柱內(nèi)條件變化，穩(wěn)定進(jìn)樣條件，調(diào)節(jié)流動(dòng)相；

? 柱快達(dá)到壽命，采用保護(hù)柱。

2、保留時(shí)間縮短

? 流速增加，檢查泵，重新設(shè)定流速；

? 樣品超載，降低樣品量；

? 鍵合相流失，流動(dòng)相PH值保持在3-7.5檢查柱的方向；

? 流動(dòng)相組成變化，防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀；

? 溫度增加，柱恒溫。

3、保留時(shí)間延長(zhǎng)

? 流速下降，管路泄漏，更換泵密封圈，排除泵內(nèi)氣泡

? 硅膠柱上活性點(diǎn)變化，用流動(dòng)相改性劑，如加三乙胺，或采用堿至鈍化柱

? 鍵合相流失，流動(dòng)相PH值保持在3-7.5檢查柱的方向；

? 流動(dòng)相組成變化，防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀；

? 溫度降低，柱恒溫。

4、出現(xiàn)肩峰或分*

? 樣品體積過(guò)大，用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于*峰的15%；

? 樣品溶劑過(guò)強(qiáng)，采用較弱的樣品溶劑；

? 柱塌陷或形成短路通道，更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

? 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品；

? 進(jìn)樣器損壞，更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子。

5、鬼峰

? 進(jìn)樣閥殘余峰，每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥，改進(jìn)閥和樣品的清洗；

? 樣品中未知物，處理樣品；

? 柱未平衡，重新平衡柱，用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對(duì)色譜)；

? (TFA)氧化(肽譜)每天新配，用抗氧化劑；

? 水污染(反相)通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水。

6、基線噪聲

? 氣泡(尖銳峰)，流動(dòng)相脫氣，加柱后背壓；

? 污染(隨機(jī)噪聲)，清洗柱，凈化樣品，用HPLC級(jí)試劑；

? 檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲，更換氘燈；

? 電干擾(偶然噪聲)，采用穩(wěn)壓電源，檢查干擾的來(lái)源(如水浴等)；

? 檢測(cè)器中有氣泡，流動(dòng)相脫氣，加柱后背壓。

7、峰拖尾

? 柱超載，降低樣品量，增加柱直徑采用高容量的固定相；

? 峰干擾，清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相；

? 硅羥基作用，加三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值，鈍化樣品；

? 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼，加在線過(guò)濾器，過(guò)濾樣品；

? 柱塌陷或形成短路通道，更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

? 死體積或柱外體積過(guò)大，連接點(diǎn)降至理想低，對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管；

? 柱效下降，用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護(hù)柱。

8、峰展寬

? 進(jìn)樣體積過(guò)大，用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于*峰的15%；

? 在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展，進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散；

? 數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢，設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)；

? 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大，設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣*峰半寬的10%；

? 流動(dòng)相粘度過(guò)高，增加柱溫，采用低粘度流動(dòng)相；

? 檢測(cè)池體積過(guò)大，用小體積池，卸下熱交換器；

? 保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫；

? 柱外體積過(guò)大，將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降?。?/span>

? 樣品過(guò)載，進(jìn)小濃度小體積樣品。