顯微鏡技術是人類進入原子時代的標志。

它把一個全新的世界展現在人類的視野里，人們第一次看到了數以百計的“新的”微小動物和植物，以及從人體到植物纖維等各種東西的內部構造。它還有助于科學家發(fā)現新物種，有助于醫(yī)生治療疾病，正逐漸被研究人員采用，因為它能夠在使用數百、數千甚至數百萬種新化合物治療后，對許多細胞的單細胞活性進行無偏倚的多參數可視化和量化。

顯微鏡技術在過去幾十年所取得的驚人進步，使得HCI(高內涵成像，High content imaging)才成為可能。

具體來說，顯微鏡現在能夠通過自動化程序獲取大量圖像。簡單點說，HCI是一種基于圖像的高通量細胞篩選方法，它將自動多色熒光成像與量化數據分析相結合，以同時評估2D和3D細胞培養(yǎng)中單個細胞的多種分子特征，以及其他生物樣本類型。

高內涵成像(HCI)

“HCI”這一術語用于指代基于圖像的主要基礎自動化高通量技術。通常指單個細胞的多個分子參數/特征(使用熒光染料測量)可以同時被評估，例如細胞周期狀態(tài)、細胞和核形態(tài)、細胞活性、受體內化、蛋白質聚集等。

HCI方法用于測量和監(jiān)測表型變化，以優(yōu)化發(fā)現和開發(fā)研究，以及早期的發(fā)現和高通量篩選(HTS)，從而實現命中先導物和先導物的優(yōu)化。最終目標是得出一系列可靠數據，通過更為直觀地理解化合物與靶點在細胞水平上的相互作用，為后期做出是否繼續(xù)的決定提供支持。

正常和癌癥類器官單獨和免疫細胞共培養(yǎng)的代表性多參數HCI圖像

正常結腸類器官(左上)

結直腸癌類器官(右上)

類腫瘤加髓細胞(左下)

類器官加免疫細胞(右下)

高內涵篩選(HCS)

HCS，可稱為高內涵成像與分析系統，是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，通過自動化細胞成像分析的方法，能快速、批量、自動地捕獲細胞、亞細胞或組織圖像，并對細胞表型進行量化處理，批量實現圖片信息到數值信息的轉換，實現了高通量圖像信息的自動提取和分析。

HCS的目的類似于其他傳統HTS(高通量篩選)方法，目標是篩選數百萬種到數億種化合物，確定新的藥物靶點和命中率，或在復雜的細胞系統(包括球體和類器官等3D培養(yǎng)物)中進行靶點和先導物優(yōu)化。

HCS采用高分辨率的熒光數碼影像系統，可以獲得被篩樣品對細胞產生的多維立體和實時快速的生物效應信息，在細胞水平上檢測多個指標的多元化，功能性篩選。與基于讀板儀(酶標儀)的傳統HTS相比，HCS被認為更具可預測性，因為高內涵成像(HCI)篩選法可顯示細胞對化合物反應的表型數據，而其可能同一個實驗中的在靶效應和/或脫靶效應有關。盡管在實驗的規(guī)劃階段必須考慮可能出現的實驗噪聲、工作流挑戰(zhàn)和數據存儲容量，但通過使用多路復用技術，可以監(jiān)控多個終點。

多個特征的HCS數據輸出的代表性熱圖示例

(左)對細胞核和肌動蛋白的快速分析

(右)全z疊加分析在一次檢測中產生300多種形態(tài)特征

雖然HCI硬件的發(fā)展速度非?？?，但分析軟件的發(fā)展速度卻沒跟上。這意味著HCS實驗往往沒有發(fā)揮其潛力。在應用方向上，根據相關研究，HCS的主要用途是小分子藥物的發(fā)現(87%)、細胞行為或分化(59%)、細胞機理研究(57%)以及比較少的是細胞安全/毒理學研究(35%)。HCS在細胞活性、細胞周期、細胞遷移、毒性檢測、受體蛋白轉位、蛋白相互作用等許多方面都有很好的應用，是藥物篩選等重要研究工具。

高內涵分析(HCA)

HCA將多參數算法應用于HCS數據，適用于從基礎科學到藥物發(fā)現篩選的一系列研究應用，可識別小分子、肽、RNAi、藥物混合物或抗體的表型或靶反應。

基于高分辨率顯微圖像，HCA在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環(huán)節(jié)的影響, 在單一實驗中獲取大量與基因及其他細胞成分相關的信息, 確定其生物活性和潛在毒性的過程。因此該技術可作為一個強大的工具來研究生理活性物質(如化合物、siRNA、 肽和抗體)的影響，并可以培養(yǎng)如斑馬魚這樣整個生物體的細胞和組織樣本。

HCA通過在復雜細胞系統(包括來自球體、類器官和共培養(yǎng)物以及微環(huán)境的多細胞結構)的背景下開發(fā)詳細的細胞生理學特征，實現對來自HCS的命中率進行優(yōu)化這一目標。換言之，精密的HCA算法現在能夠在HCS實驗中對細胞系進行非常復雜的分析，最終提供具備高度可預測性和高度可轉化性的臨床前數據來預測體內效應。

用于生成復雜細胞系統詳細特征的類器官的HCA圖像示例

高內涵成像/篩選/分析與類器官相結合的分析應用

類器官是微型化和簡化的體外器官模型系統，是組織發(fā)育和疾病模型建立、個性化醫(yī)學、藥物篩選和細胞治療等領域的研究熱點。類器官又被稱為迷你器官，這是一種被定義為體外培養(yǎng)的能夠自我更新、自我組織，并具有來源組織器官功能的3D細胞簇，其來源于組織中的一個或幾個細胞，例如胚胎干細胞(ESCs)、誘導多功能干細胞(iPSC)和成體干細胞(ASCs)，這些干細胞可以擴展為多種組織類型。類器官通常包含細胞的共培養(yǎng)物并顯示出高度的自組裝性，因此與傳統的二維(2D)細胞培養(yǎng)物相比，可以更好地顯示復雜的體內細胞應答以及相互作用。

在類器官自動成像中，改善類器官表型變化的定量評估以及增加實驗和檢驗中通量而言，類器官的自動成像和分析是非常重要的。共聚焦成像系統經常被用來深入評估類器官的形態(tài)。而3D類器官培養(yǎng)被視為HCS里最需要共聚焦模式成像的應用，共聚焦成像對于捕獲3D生物檢測分析的復雜性尤其有用。

如前所述，HCS可與類器官結合使用，其顯著的臨床可預測性與在原始組織中觀察到的關鍵表型(如結構和細胞異質性)和遺傳特征的重現有關。在腫瘤學項目的背景下，腫瘤類器官具有高度的臨床相關性，是發(fā)現藥物和生物標志物的良好平臺。

基于圖像的高通量技術能夠開發(fā)具備高度可預測性和高度可轉化性的臨床前數據，以預測體內效應，尤其是與高度患者相關的3D類器官培養(yǎng)相結合時。高內涵分析工具能夠確定和測定每個類器官中的單個細胞、細胞核或細胞器。并對活細胞、細胞或有特異性標記物的細胞進行計數，并且能夠確定其體積大小以及彼此間的距離。

因此，3D類器官結構的成像系統需要滿足的條件首先成像放大系統，照明的靈活性以及提高圖像采集速度的模式。當空間尺度較小的細胞團成像時，需要的條件包括具有系統的高靈敏度，比如系統的高激發(fā)效率和成像檢測器的高靈敏度。系統的高激發(fā)效率保證了只需要較低的激發(fā)光強度實現對整個細胞團的激發(fā)。其次便是成像系統能夠高速成像。

目前，HCS系統正越來越多地用于3D細胞模型和表型分析的分析，在未來也將發(fā)揮著越來越重要的作用。